QUÉ OFRECEMOS

• VECTORES CON MARCADORES FLUORESCENTES

  En colaboración con el Grupo de la Dra. Paloma López del Centro de Investigaciones Biológicas (CIB, CSIC) hemos desarrollado vectores de fusión transcripcional que permiten la detección de regiones promotoras uni- y bidireccionales en bacterias lácticas. Estos vectores están patentados (Patente P201130356, PCT\ES2012\070163) y se comercializan a través de la empresa Solmeglas (www.http://www.solmeglas.com/gb/118-expression-vectors) a aquellos grupos de investigación o empresas que estén interesadas.

  

  Los vectores contienen como marcadores un gen mrfp sintético que codifica la proteína fluorescente roja mCherry (pTLR) y el gen gfp que codifica la proteína fluorescente verde GFP (pTLGR). Los plásmidos son de utilidad en la caracterización de regiones promotoras y para la expresión de genes divergentes al codificar dos proteínas con espectros de emisión de fluorescencia perfectamente separados. La expresión de fluorescencia puede ser detectada en tiempo real lo que permite establecer las condiciones ambientales (p. ej. nutrientes) que intervienen en la regulación genética, así como los mecanismos de interacción entre bacterias, tanto potencialmente probióticas como patógenas, y con las células eucariotas del hospedador.

  Los vectores desarrollados son:

  • pTLR para la evaluación de promotores transcripcionales en Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis y Escherichia coli. Contiene como reportero un gen mrfp sintético que codifica la proteína fluorescente mCherry.

  • pTLGR para la evaluación de promotores divergentes transcripcionales en L. lactis, E. faecalis y E. coli. Contiene como reporteros fluorescentes los genes gfp y mrfp.

  
  Referencias:
  

  • Patente P201130356.
    Inventores (p.o. de firma): García-Cayuela, T., Mohedano, M.L., Pérez-Gómez de Cadiñanos, M.L., Fernández de Palencia, P., Boden, D., Wells, J., Peláez, C., López, P., Requena, T.
    Título: Vectores de fusión transcripcional para regiones promotoras uni- y bidireccionales para su uso en bacterias lácticas.
    País de prioridad: España.      Fecha de prioridad: 2011
    Entidad titular: CSIC
    Empresas que la están explotando: MYGEN. Contrato de Licencia para explotación no exclusiva en el territorio nacional.
    

  • Patente internacional PCT 2012: PCT\ES2012\070163
    Título: Vectores de fusión transcripcional para regiones promotoras uni- y bidireccionales para su uso en bacterias lácticas.
    Fecha de prioridad: 2012
    

  
  Artículos
  
  • García-Cayuela, T., Gómez de Cadiñanos, L.P., Mohedano, M.L., Fernández de Palencia, P., Boden, D., Wells, J., Peláez, C., López, P. and Requena, T. Fluorescent protein vectors for promoter analysis in lactic acid bacteria and Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96:171-181, 2012.
  
  
  

  PROCEDIMIENTO PARA LA DIFERENCIACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS Y BIFIDOBACTERIAS

  Hemos desarrollado procedimientos que permiten la identificación y cuantificación selectiva y diferencial de cuatro especies de bacterias lácticas (Streptococcus thermophilus; Lactobacillus bulgaricus; Lactobacillus casei; Lactobacillus acidophilus) y de Bifidobacterium lactis, en cultivos mixtos presentes en leches fermentadas. Los procedimientos están registrados en las Patentes 200601788 y 200601789. Ofrecemos la licencia de comercialización de los procedimientos a empresas especializadas en medios de cultivo para análisis microbiológico de alimentos y kits de diagnóstico.

  Una de las novedades de las técnicas y que aporta ventajas respecto de las existentes es que se puede distinguir simultáneamente tres especies diferentes de lactobacilos entre sí y frente a otra bacteria láctica como S. thermophilus y a bifidobacterias, todo ello basado en el empleo de diferentes condiciones de incubación y/o en la diferenciación por morfología de las colonias, pero sin adición de antibióticos a los medios de cultivo que pudieran comprometer la viabilidad de las especies en estudio.

  La validación del procedimiento se realizó en base al estudio de la selectividad de los medios, la exactitud y precisión para recuperar la población ensayada, la reproducibilidad del procedimiento y el análisis de la posible competencia entre las especies. También se analizaron el efecto matricial mediante la cuantificación de las poblaciones en leche acidificada en comparación con los medios de cultivo de referencia.

  
  Referencias:
  

  • Patente nº 200601788.
    Inventores (p.o. de firma): Tabasco, R., Paarup, T., Janer, C., Peláez, C., Requena, T.
    Título: Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas.
    País de prioridad: España.      Fecha de prioridad: 2006
    Entidad titular: CSIC
    

  • Patente nº 200601789.
    Inventores (p.o. de firma): Tabasco, R., Paarup, T., Janer, C., Peláez, C., Requena, T.
    Título: Procedimiento para diferenciar y cuantificar bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas que emplea medios de cultivo selectivos libres de antibióticos.
    País de prioridad: España.      Fecha de prioridad: 2006
    Entidad titular: CSIC
    

  
  Artículos
  
  • Tabasco, R. Paarup, T., Janer, C., Peláez, C. and Requena, T. 2007. Selective enumeration and identification of mixed cultures of S. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk. International Dairy Journal 17: 1107-1114. 2007.

  
  

  
  
  

  LACTOCOCOS PRODUCTORES DE BACTERIOCINAS

  Ofrecemos microorganismos de la especie Lactococcus lactis (IFPL 3593 e IFPL105) que producen la bacteriocina lacticina 3147 de amplio espectro de acción y mecanismo lítico frente a bacterias sensibles. L. lactis IFPL 3593 puede ser utilizado como parte de un cultivo iniciador para quesos y el procedimiento de utilización se encuentra protegido bajo la Patente nº 2.170.723 (ES2001100090). Por su parte, la elevada producción de lacticina 3147 por L. lactis IFPL105 puede favorecer la aplicación de la bacteriocina producida como bioconservante en alimentos listos para el consumo, como cárnicos y vegetales.

  La comercialización de ambos microorganismos se ofrece a empresas de los sectores lácteo, cárnico y vegetales, así como a empresas comercializadoras de cultivos iniciadores.

  L. lactis IFPL3593 contiene el plásmido no conjugable de 46 kb (pBAC105) presente originalmente en Lactococcus lactis IFL105, que codifica la producción e inmunidad de la bacteriocina. La capacidad acidificante de L. lactis IFPL3593 le permite actuar como starter durante la elaboración del queso. La bacteriocina producida durante su crecimiento induce la lisis de otras bacterias lácticas presentes o añadidas al queso sin interferir en el proceso de fermentación inicial de la leche y por tanto, sin provocar problemas de acidificación de la cuajada.

  El resultado es una aceleración de la maduración del queso y un desarrollo más temprano de sus características organolépticas. Además, este microorganismo presenta el valor añadido de ser activo frente a esporas de Clostridium tyrobutyricum impidiendo la germinación de las mismas, por lo que actúa como cultivo bioprotector evitando el hinchamiento tardío de los quesos semiduros que frecuentemente se produce por clostridios.

  
  Referencias:
  

  • Patente nº 2.170.723 (ES2001100090).
    Inventores (p.o. de firma): Martínez-Cuesta, M.C., Requena, T., Peláez, C.
    Título: Lactococcus lactis productor de bacteriocina utilizable como cultivo iniciador para acelerar la maduración de queso.
    País de prioridad: España.      Fecha de prioridad: 2001
    Entidad titular: CSIC
    

  
  Artículos
  
  • Martínez Cuesta, M.C., Peláez, C. Juárez, M. and Requena, T. Autolysis of certain lactococci and lactobacilli strains. Cell lysis induced by a bacteriocin. International Journal of Food Microbiology 38: 125 131. 1997.
    
    
  • Martínez Cuesta, M.C.; Fernández de Palencia, P.; Requena, T. and Peláez, C. Enhancement of proteolysis by a Lactococcus lactis bacteriocin producer in a cheese model system. Journal of Agricultural and Food Chemistry 46: 3863 3867. 1998.
    
    
  • Martínez Cuesta, M.C., Kok, J., Herranz, E., Peláez, C. Requena, T. and Buist, G. Requirement of autolytic activity for bacteriocin induced lysis. Applied Environmental Microbiology. 66: 3174 - 3179. 2000.
    
    
  • Martínez Cuesta, M.C., Buist, G., Kok, J., Hauge, H.H., Nissen Meyer, J., Peláez, C. and Requena, T. Biological and molecular characterization of a two peptide lantibiotic produced by Lactococcus lactis IFPL105. Journal Applied Microbiology 89: 249 260. 2000.
    
    
  • Martínez Cuesta, M.C., Requena, T. and Peláez, C. Use of a bacteriocin producing transconjugant as starter in acceleration of cheese ripening. International Journal of Food Microbiology 70:79-88. 2001.
    
    

  
  

  
  
  

  COLECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS

  A lo largo de los años el Grupo ha generado una colección de bacterias lácticas compuesta por alrededor de 500 cepas que corresponden a los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc y Enterococcus, aisladas en su mayoría de productos lácteos fermentados artesanales sin contacto previo con cultivos comerciales. Esta característica aporta un importante valor añadido a la colección bacteriana ya que se han descrito bastantes características presentes en cepas silvestres de las que carecen las cepas industriales.

  

  Una parte importante de estas cepas se ha identificado por métodos moleculares fundamentalmente secuenciación del gen 16S- rDNA y RAPD y más recientemente se han aplicado técnicas de espectrometría MALDI-TOF/TOF para la identificación bacteriana en función de sus perfiles peptídicos, con el objetivo añadido de obtener su caracterización funcional. Además, en muchas cepas de interés se han caracterizado propiedades tecnológicas a nivel molecular como el sistema proteolítico, catabolismo de aminoácidos- aminotransferasas, glutamato dehidrogenasa, liasas y cetoácido decarboxilasa- y producción de bacteriocinas.

  Ofrecemos a empresas que innoven en diseño y desarrollo de nuevos cultivos iniciadores, la posibilidad de colaborar en la explotación de esta colección aprovechando el conocimiento y know how adquirido por el Grupo en la caracterización molecular de la misma.

  
  
  

  LACTOBACILO SINGULAR EN EL METABOLISMO INTESTINAL DE COMPUESTOS BIOACTIVOS

  Lactobacillus plantarum IFPL935, procedente de nuestra colección, es un microorganismo que metaboliza polifenoles, como flavan-3-oles monoméricos y galoil derivados por acción de las actividades galoil-esterasa, descarboxilasa y benzil-alcohol deshidrogenasa. Es además capaz de romper el anillo C (heterociclo) de monómeros de flavan-3-oles para producir el difenilpropan-2-ol correspondiente. Se ha evaluado también la interacción de esta bacteria y compuestos fenólicos en el epitelio intestinal, es decir, absorción y metabolismo, mediante líneas celulares. Además, la capacidad de producir difenilpropan-2-ol por L. plantarum IFPL935 a partir de extractos de pepita de uva se ha reproducido en incubaciones de la cepa junto con microbiota fecal humana. Lactobacillus plantarum IFPL935 posee por tanto una capacidad metabólica propia de ciertas bacterias intestinales pero no descrita hasta ahora en esta especie, lo que abre potencialmente vías importantes de aplicación de este microorganismo en el sector de la alimentación funcional.

  Ofrecemos por una parte a grupos de investigación y a grupos clínicos interesados en la investigación sobre probióticos y salud intestinal, la posibilidad de colaborar en desarrollos científicos relacionados con la potencial actividad beneficiosa de este microorganismo en el intestino y su capacidad de producir metabolitos bioactivos a partir de polifenoles de plantas.

  Por otra parte, ofrecemos a empresas del sector vitivinícola, zumos y derivados, así como a empresas comercializadoras de cultivos probióticos, la posibilidad de colaborar en la explotación comercial de esta bacteria probiótica.

  
  Referencias:
  
  • Tabasco, R., Sánchez-Patán, F., Monagas, M., Bartolomé, B., Moreno-Arribas, M.V., Peláez, C., Requena, T. Effect of grape polyphenols on lactic acid bacteria and bifidobacteria growth: resistance and metabolism. Food Microbiology 28: 1345-1352. 2011.
    
    
  • Sánchez-Patán, F., Tabasco, R., Monagas, M., Requena, T., Peláez, C., Moreno-Arribas, M.V., Bartolomé, B. Capability of Lactobacillus plantarum IFPL935 to catabolize flavan-3-ol compounds and complex phenolic extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry 60: 7142–7151. 2012.
    
    
  • Bustos, I., García Cayuela, T., Hernández-Ledesma, B., Requena, T., Martínez Cuesta, M.C. Effect of flavan-3-ols on the adhesion of potential probiotic lactobacilli to intestinal cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry 60: 9082-9088. 2012.
    
    

  
  

  Degradación de flavan-3-oles por Lactobacillus plantarum IFPL935